迟发型超敏反应（DTH）试验：原理、方法与应用
摘要
迟发型超敏反应（Delayed-Type Hypersensitivity, DTH），亦称IV型超敏反应，是由抗原特异性T淋巴细胞介导的细胞免疫反应，通常在接触抗原后24-72小时达到高峰。DTH试验不仅是评估机体细胞免疫功能状态的重要窗口，也是诊断特定感染性疾病、监测疫苗免疫效果及评价药物潜在免疫毒性的关键工具。本文系统阐述了DTH试验的检测项目、方法原理、应用范围及所需仪器。
DTH试验的核心是体内皮试法，通过皮内注射抗原，观察局部由T细胞和巨噬细胞浸润引起的炎性反应。
1.1 标准皮内试验（如结核菌素试验，PPD试验）
原理：将已知抗原（如纯化蛋白衍生物，PPD）皮内注射至前臂掌侧。致敏个体中，抗原被局部抗原提呈细胞捕获并提呈给记忆性CD4+ Th1细胞和CD8+ T细胞。这些细胞被激活后，分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF）等细胞因子，募集并激活单核/巨噬细胞，导致注射部位出现以单核细胞浸润为主的渗出性炎症，表现为红斑、硬结。
结果判读：通常在注射后48-72小时测量硬结的平均直径（横径与纵径之和除以2）。硬结直径≥5mm（免疫抑制人群标准可能不同，如≥10mm）通常视为阳性，提示既往感染或成功免疫接种产生了特异性细胞免疫记忆。
1.2 斑贴试验
原理：主要用于诊断接触性皮炎。将可疑致敏原置于特制小室内，贴敷于患者背部皮肤。若患者对该物质致敏，致敏原穿透表皮角质层与朗格汉斯细胞结合，迁移至局部淋巴结，激活T细胞。活化的效应T细胞再循环至皮肤抗原接触部位，引发DTH反应。
结果判读：贴敷48小时后移除斑贴器，分别在移除后48小时及96小时观察皮肤反应。阳性反应表现为红斑、丘疹、水疱甚至坏死。根据反应强度进行分级（如±， +， ++， +++）。
1.3 淋巴细胞转化试验（LTT）与细胞因子检测（体外替代方法）
原理：作为体内皮试的体外补充或替代。将患者外周血单个核细胞（PBMCs）在体外与特定抗原共同培养。
LTT：特异性记忆T细胞识别抗原后被激活，发生母细胞化和增殖。通过检测增殖程度（常用方法：³H-胸腺嘧啶核苷掺入法或CFSE荧光稀释法）来间接反映机体对该抗原的细胞免疫记忆强度。
细胞因子检测：采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）或流式细胞内细胞因子染色法，直接检测抗原刺激后T细胞分泌的效应细胞因子（特别是IFN-γ）。IFN-γ ELISPOT已成为评估结核感染（如结核感染T细胞斑点试验，T-SPOT.TB）等的重要体外DTH检测方法。
DTH试验的应用广泛，主要涵盖以下领域：
传染病诊断与免疫评估：
结核病：PPD试验是筛查结核感染的经典方法。γ-干扰素释放试验（IGRAs，基于ELISPOT或酶联免疫吸附法）作为体外检测，特异性更高，不受卡介苗接种和非结核分枝杆菌感染影响。
其他感染：用于某些真菌病（如组织胞浆菌病、球孢子菌病）、部分寄生虫病及某些病毒感染的流行病学调查和免疫状态评估。
免疫缺陷病诊断：通过使用回忆抗原（如破伤风类毒素、白色念珠菌抗原、腮腺炎病毒抗原）进行皮试，评估患者是否存在普遍的细胞免疫功能缺陷，如重症联合免疫缺陷病、HIV感染/AIDS。
过敏性疾病诊断：
接触性皮炎：斑贴试验是诊断金属（如镍、铬）、橡胶、化妆品、外用药物等引起的变应性接触性皮炎的“金标准”。
疫苗研发与效果评价：在疫苗临床试验中，DTH皮试可作为评估疫苗诱导细胞免疫应答的指标之一。
药物免疫毒性评价：在药物非临床安全性评价中，通过检测药物对实验动物DTH反应的影响，评估其潜在的免疫抑制或增强作用。
器官移植免疫监测：历史上曾用于评估受者的免疫反应性，现多被更精确的体外免疫学方法取代。
体内方法：
皮内注射试验。
斑贴试验。
体外方法：
酶联免疫斑点法（ELISPOT）：定量检测抗原特异性T细胞分泌的IFN-γ等细胞因子。高灵敏度，可进行细胞计数。
γ-干扰素释放试验（IGRAs）：基于ELISA或ELISPOT平台，定量检测全血或PBMCs经结核特异性抗原刺激后释放的IFN-γ水平。
流式细胞术：
胞内细胞因子染色（ICS）：通过多色流式分析，同时鉴定分泌特定细胞因子的T细胞亚群。
增殖标志物检测（如CFSE稀释、Ki-67表达）。
淋巴细胞转化试验（LTT）：通过放射性同位素掺入或荧光染料稀释法评估T细胞增殖。
DTH试验的进行依赖于一系列实验室和临床设备。
皮试相关器械：
结核菌素注射器：1ml专用蓝芯注射器，用于精确皮内注射。
斑贴试验器：由惰性材料制成的标准小室，用于承载待测物并固定于皮肤。
刻度尺或卡尺：透明、带有毫米刻度的硬质尺，用于精确测量皮肤硬结或红斑的直径。
体外检测核心仪器：
酶联免疫斑点分析仪：自动读取和分析ELISPOT板，计数斑点形成细胞（SFC）。
流式细胞仪：用于多参数分析细胞表面标志物和胞内细胞因子，是进行ICS和增殖分析的关键设备。
酶标仪：用于读取ELISA、IGRA等检测的光密度（OD）值。
细胞培养设备：包括二氧化碳培养箱、生物安全柜、离心机等，用于PBMCs的分离和体外培养。
液体闪烁计数仪或微孔板闪烁计数仪：用于检测³H-胸腺嘧啶核苷掺入试验中的放射性信号（现使用逐渐减少）。
辅助设备：
显微镜：用于细胞形态学观察和计数。
图像采集系统：用于记录皮试或斑贴试验的皮肤反应图像，便于存档和会诊。
结论
迟发型超敏反应试验是一个多层次、多方法的检测体系。经典的体内皮试法因其直观、经济的特点，在临床筛查和功能评估中仍具重要地位。而基于ELISPOT、流式细胞术等现代免疫学技术的体外方法，以其更高的特异性、可量化及标准化潜力，正日益成为基础研究与精准医疗中的重要工具。选择何种方法取决于具体的检测目的、可用资源以及对灵敏度、特异性的要求。未来，随着多组学技术和单细胞分析技术的发展，对DTH背后复杂的细胞与分子网络的理解将更加深入，推动检测技术向更精准、更动态的方向演进。