烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide, NADH）及其氧化形式NAD⁺是存在于所有活细胞中的关键辅酶，在能量代谢、氧化还原稳态、信号传导和基因表达调控中扮演核心角色。细胞内NADH/NAD⁺的比值是反映细胞代谢状态的重要指标，准确检测NADH的含量对于基础生命科学研究、临床诊断、药物开发及工业生物过程监控具有重要意义。
NADH检测主要基于其特有的物理化学及生物化学性质。检测可分为对总NAD(H)（NAD⁺与NADH之和）、NADH单独含量以及原位NADH的检测。
1. 光谱法
紫外-可见吸收光谱法：NADH在260 nm（腺嘌呤特征吸收峰）和340 nm（还原型烟酰胺环的特征吸收峰）处有最大吸收。通过测量340 nm处的吸光度值，可直接定量溶液中的NADH浓度。该方法简单、快速，但易受其他在340 nm有吸收的物质（如血红蛋白、某些药物）干扰，且无法区分游离与结合态的NADH。
荧光光谱法：NADH在激发光波长~340 nm照射下，于~460 nm处发射荧光，而NAD⁺无此荧光特性。该法灵敏度（通常在纳摩尔级别）远高于吸收光谱法，特异性好，是检测微量NADH的主流方法。可进一步用于细胞和组织原位成像，通过监测NADH的荧光强度与寿命，反映细胞的代谢类型（如糖酵解 vs. 氧化磷酸化）。
2. 酶循环法
此法通过构建特异性酶反应来放大信号，实现极高灵敏度的检测（可达皮摩尔甚至飞摩尔级别）。
原理：利用乙醇脱氢酶（ADH）或乳酸脱氢酶（LDH）等工具酶，以NADH为辅助因子，催化特定底物（如丙酮酸、草酰乙酸）发生还原反应，同时NADH被氧化为NAD⁺。通过偶联另一个能产生可检测信号（如荧光、化学发光）的指示反应，将NADH的消耗或产物的生成转化为可定量信号。通过精确控制反应条件，可实现NAD⁺与NADH的特异性分别检测。
3. 电化学法
原理：基于NADH在电极表面的直接电化学氧化（通常在+0.4 V至+0.7 V vs. Ag/AgCl电位下）。然而，NADH的直接氧化过电位高，易导致电极污染和灵敏度下降。因此，常使用电子媒介体（如亚甲蓝、二茂铁及其衍生物）或修饰有纳米材料（如碳纳米管、石墨烯、金属纳米粒子）的电极来降低工作电位、增强电流响应并提高稳定性。该法适用于在线监测和便携式设备开发。
4. 化学发光与生物发光法
原理：利用NADH作为关键辅因子参与生物发光反应。最经典的系统是细菌荧光素酶系统，其中NADH:FMN氧化还原酶消耗NADH，将FMN还原为FMNH₂，后者在荧光素酶作用下与长链醛及氧气反应产生光信号。光强度与NADH浓度成正比。该法具有极高的灵敏度和宽线性范围。
5. 色谱与质谱联用法
高效液相色谱（HPLC）与液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）：通过色谱柱（如C18反相柱）分离NAD⁺、NADH及其他代谢物，再结合紫外、荧光或质谱检测器进行定性和绝对定量。LC-MS/MS利用多反应监测（MRM）模式，特异性极强，能同时精确测定多种辅酶及其衍生物（如NADPH）的含量，是代谢组学研究中的金标准方法。该方法前处理需注意快速淬灭细胞代谢以防止相互转化。
细胞代谢与生物能量学研究：监测线粒体功能、糖酵解速率、氧化应激状态。评估细胞在不同病理条件（如癌症、神经退行性疾病）或药物处理下的代谢重编程。
临床诊断与疾病标志物：血液或组织中NADH/NAD⁺比值的变化与多种疾病相关，如败血症、帕金森病、糖尿病、心力衰竭等。可作为潜在的诊断或预后指标。
药物筛选与药理学研究：评估影响能量代谢的药物的效力和机制（如化疗药物、线粒体毒素、NAD⁺前体补充剂如烟酰胺单核苷酸/NMN）。
食品工业与发酵工程：监控发酵过程中（如酸奶、酒精饮料生产）微生物的代谢活性和细胞密度，优化工艺条件。
环境微生物学：评估环境样品中微生物群落的总体代谢活性。
酶动力学分析：在酶学实验中，NADH的生成或消耗速率直接反映了脱氢酶类酶的活性。
实际操作中需根据样本类型和目标选择方法：
细胞/组织提取液中NADH定量：
酸/碱萃取法：利用NADH在酸性条件下稳定而NAD⁺在碱性条件下稳定的特性，分别制备酸提取液（含NADH）和碱提取液（含NAD⁺），然后用酶循环法或荧光法分别测定。
热萃取法：快速淬灭代谢，并用适当的缓冲液提取总NAD(H)。
原位/活细胞NADH监测：
荧光显微成像/共聚焦显微镜：使用340 nm双光子或单光子激发，收集450-470 nm发射光，可视化细胞质和线粒体中NADH的分布。
荧光寿命成像显微镜（FLIM）：测量NADH的荧光寿命，可区分其游离态（~0.4 ns）和与蛋白质结合态（~1-3 ns），提供更丰富的代谢状态信息。
高通量筛选：基于荧光或生物发光的微孔板读数法，适用于96孔或384孔板格式，可用于大规模药物筛选。
紫外-可见分光光度计：用于340 nm处NADH的直接吸收测量，适用于高浓度样品（微摩尔级以上）的快速检测。
荧光分光光度计与微孔板读数仪：核心检测设备。前者用于扫描样本的激发发射光谱，后者专为多孔板设计，可实现高通量、自动化的荧光强度检测，是酶循环法和高通量筛选的主要平台。
化学发光/生物发光检测仪：具有高灵敏度的光子计数器，用于检测由NADH依赖的生物发光反应产生的微弱光信号。
高效液相色谱仪与液相色谱-串联质谱仪：HPLC配备紫外/荧光检测器可用于常规分离定量；LC-MS/MS则是进行绝对定量和复杂样本代谢组学分析的最高端设备，提供无与伦比的特异性和准确性。
电化学工作站：用于开发和研究基于电极的NADH传感器，可进行循环伏安法、安培法等测试。
荧光显微镜与共聚焦荧光寿命成像系统：
宽场/共聚焦荧光显微镜：配备紫外/近紫外激光器（如355 nm或405 nm激光）和相应的发射滤光片，用于活细胞NADH荧光强度成像。
荧光寿命成像显微镜：结合时间相关单光子计数技术，可定量绘制细胞内NADH荧光寿命图谱，是研究代谢异质性的尖端工具。
总结：NADH检测技术已发展成为一个多维度、多层次的工具箱。从简单的溶液吸光度测量到复杂的单细胞代谢成像，方法的选择取决于检测目标（总量 vs. 原位分布）、灵敏度需求、样本通量以及预算。随着光学技术、纳米材料和质谱技术的持续进步，NADH检测正朝着更高灵敏度、更高时空分辨率、更高通量和多参数联用的方向发展，从而更深刻地揭示生命过程的能量奥秘。