皮肤致敏性评估技术综述
皮肤致敏，即过敏性接触性皮炎，是一种由化学物质诱导的IV型迟发型超敏反应。该过程分为两个阶段：致敏阶段（诱导期）和激发阶段（效应期）。对化学品、化妆品、医疗器械、药品及工业原料进行可靠的皮肤致敏性评估，是保障产品安全、符合全球法规要求的关键环节。加合物的形成，评估反应性。
关键事件2：角质形成细胞激活：致敏原会诱发皮肤角质形成细胞的炎症反应，释放特定的细胞因子和趋化因子。
Keratinosens™ 试验：利用报告基因技术，检测人角质形成细胞系中抗氧化反应元件（ARE）依赖性基因（如Nrf2通路下游基因）的上调。该通路的激活与细胞应激和炎症启动相关。
IL-8/Luc 试验（LuSens）：原理类似，通过检测报告基因表达来评估角质形成细胞中IL-8（一种关键趋化因子）启动子的激活情况。
关键事件3：树突状细胞激活：皮肤朗格汉斯细胞（一种树突状细胞）被激活，成熟并迁移至淋巴结。
人细胞系激活试验（h-CLAT）：使用人单核细胞白血病细胞系（THP-1）作为朗格汉斯细胞的模型。通过流式细胞术检测细胞表面共刺激分子（如CD86和CD54）的表达上调，以此评估树突状细胞的激活状态。
U937皮肤致敏试验（U-SENS）：原理与h-CLAT类似，使用U937细胞系，主要检测CD86的表达变化。
关键事件4：T细胞增殖与激活：在淋巴结中，抗原呈递细胞将抗原呈递给特异性T细胞，引发其克隆性增殖。
局部淋巴结试验（LLNA）：是目前唯一得到广泛认可的体内试验。原理是在小鼠耳部皮肤重复涂抹受试物，通过检测引流淋巴结中淋巴细胞增殖的程度（通常通过放射性胸腺嘧啶脱氧核苷或溴脱氧尿苷的掺入量来定量）来评估致敏性。其改良法（如LLNA: DA）使用非放射性标记物。
过客淋巴细胞活化试验（PLLA）：一种体外替代方法，原理是将受试物与树突状细胞共孵育后，再与同种异体T细胞共培养，通过检测T细胞增殖（如CFSE染色法）或细胞因子分泌来评估T细胞激活。
皮肤致敏性评估覆盖了广泛的行业与产品领域，主要受法规驱动。
化妆品及个人护理品：所有终产品及原料均需进行安全性评估。欧盟化妆品法规等明确要求禁止使用动物试验，推动体外替代方法的全面应用。
化学品与工业原料：根据全球化学品统一分类和标签制度（GHS）及欧盟《化学品注册、评估、授权和限制法规》（REACH）等，对产量或进口量达到一定吨位的化学品必须进行致敏性分类和标签。
医疗器械：对于与皮肤或黏膜接触时间超过30天的医疗器械（如敷料、膏贴、外科手套），需依据ISO 10993-10标准进行致敏性评估。
药品：外用制剂（如膏剂、贴剂）和可能引发全身性接触性皮炎的药物需进行致敏性评估，作为临床前安全性评价的一部分。
农药、消毒剂及家用产品：确保直接或间接接触操作人员或消费者时的安全性。
评估方法分为体内法、体外法及计算机预测模型。
体内方法：
豚鼠试验：传统经典方法，包括豚鼠最大值试验（GPMT）和Buehler试验（BT）。通过皮内注射或表皮涂抹进行诱导，一段时间后于新部位进行激发，观察红斑和水肿反应。由于动物福利和3R原则，其使用已大幅减少。
局部淋巴结试验（LLNA）：作为一项体内试验，因其客观定量、使用动物数量相对较少而被经济合作与发展组织（OECD）采纳为标准指南（TG 429）。但仍属动物试验，其应用正逐步受限。
体外方法（替代方法）：
上述基于关键事件的DPRA（OECD TG 442C）、ADRA（OECD TG 442D）、Keratinosens（OECD TG 442D）、LuSens、h-CLAT（OECD TG 442E）和U-SENS（OECD TG 442E）等，均已获得OECD认可。
整合测试与评估方法（IATA）：由于单一体外方法无法覆盖所有关键事件，通常采用“证据权重法”，结合多个体外和计算机模拟结果，进行综合判断。常见策略是结合蛋白质反应性试验（如DPRA）与细胞激活试验（如h-CLAT或Keratinosens），有时还加入皮肤渗透性数据进行预测。
计算机预测模型（in silico）：
基于定量构效关系（QSAR）和专家规则系统，通过分析化学物质的结构特征来预测其致敏潜力。常用工具包括统计模型和对已知致敏机理的规则化总结。这些模型常用于初步筛选和优先级排序。
皮肤致敏性评估的现代化和体外化高度依赖精密的分析仪器。
高效液相色谱仪（HPLC）与超高效液相色谱仪（UPLC）：
功能：是DPRA、ADRA等肽/氨基酸反应性试验的核心设备。用于分离和定量分析反应体系中的游离肽/氨基酸及其加合物，通过测定峰面积或峰高计算反应消耗率。
液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）：
功能：在ADRA等更高阶的分析中提供更精准的定性和定量能力。能够明确鉴定加合物的结构，并对其进行高灵敏度、高选择性的定量，提高数据的可靠性。
流式细胞仪：
功能：是h-CLAT、U-SENS等细胞激活试验的必备设备。通过激光激发被荧光抗体标记的细胞，快速、多参数地分析成千上万个细胞表面标志物（CD86、CD54）的表达水平，精确计算表达上调的倍数。
微孔板读数器（多功能酶标仪）：
功能：用于Keratinosens、LuSens等报告基因试验以及MTT细胞活力测定。可检测荧光素酶活性、吸光度（用于细胞毒性检测）、荧光强度等多种信号，实现高通量、自动化的96或384孔板检测。
实时荧光定量PCR仪（qPCR）：
功能：可用于补充验证基因表达的变化。虽然报告基因法是主流，但qPCR可以直接定量内源性生物标志物（如HO-1、IL-8）的mRNA表达水平，为细胞激活提供更直接的分子证据。
细胞培养系统（生物安全柜、CO2培养箱）：
功能：为所有基于细胞的体外试验（h-CLAT、Keratinosens等）提供无菌、恒温恒湿的细胞培养环境，是保证细胞活性和试验重现性的基础。
结论
皮肤致敏性评估已从依赖动物实验的传统模式，成功转型为以机制为基础、以关键事件为导向的整合测试策略。通过结合计算机预测、基于分子和细胞水平的体外试验以及合理的体外-体内外推模型，科学界和工业界能够在遵循3R原则的前提下，对物质的皮肤致敏潜力进行准确、可靠的评估。随着对致敏机制更深入的理解和新生物标志物的发现，评估方法将继续向更高通量、更自动化、更具预测性的方向发展。